La technique HIC est également connue sous le nom de “Salting out”. La séparation se fait suivant l’hydrophobicité des molécules. Dans un tampon salin donné, les molécules seront éluées par ordre croissant d’hydrophobicité.
Toutes les protéines présentent des domaines hyrdophobes et des domaines hydrophiles. La présence de sel va exposer les domaines hydrophobes. Chargées dans une colonne de HIC (colonne remplie d’une résine hydrophobe), la molécule est retenue. En appliquant un gradient d’élution de force ionique diminuant, les molécules sont éluées.
Cette technique dépend du sel utilisé, de sa concentration, du pH, de la température et des additifs.
Les ligands de la résine hydrophobes sont le plus souvent des groupements Ether, Béthyl ou Phényl.

Techniques chromatographiques

 

Analyse & Purification de Proteines

HIC

A) En contact de groupements hydrophobes l’eau est parfaitement structurée : les parties hydrophobes ne peuvent se lier.
B) Le sel détruit la structure de l’eau : les groupements hydrophobes se lient.

 

RPC

Domaines d’applications :

  • ADC : Antibody Drug Conjugate : les molécules liées aux anticorps sont hydrophobes, en fonction de leur nombre, les ADC sont plus ou moins hydrophobes
  • Détermination des DAR: Drug Antibody Ratio
  • Études des repliements des protéines
HIC

Avantages

  • Conditions douces, non dénaturant
  • Rendement important
  • L’activité biologique des protéines est préservées
  • Échantillon élué dans de faibles concentration salines
  • Très bien adapté pour être suivi d’une étape de SEC (Size Eclusion Chromatography), IEX (Ion Exchange Chromatography) ou affinité

Désavantage

  • L’échantillon doit être chargé dans un tampon de grande force ionique

 

Principe de la séparation

HIC

  • Les protéines présentent des réions hydrophobes et des régions hydrophiles.
  • En tampons aqueux de faibles concentration saline (faible force ionique), les molécules sont entourées par une fine couche de molécules d’eaux arrangées.
  • En grande concentration saline, la solvatation des protéines diminue, les régions hydrophobes sont exposées et donc la protéine peut être adsorbée sur une résine hydrophobe.

 

Caractéristiques

HIC - Caractéristiques

  • Les molécules sont séparées par ordre croissant d’hydrophobicité
  • Le pouvoir résolutif est limité
  • La quantité de sel nécessaire est très importante (~ 2 M ammonium sulfate)
  • La phase stationnaire ne doit pas être trop hydrophobe (Ligand C4 en faible concentration)

 

Facteurs influents

1. Ligand & degré de substitution

HIC - Ligand & degré de substitution
  • La capacité de liaison augmente avec la longueur de la chaine alkyl et du degré de substitution
  • Si ce degré est trop important il y a création de multi points de liaison et donc difficulté d’élution
  • Le degré de substitution est plus faible qu’en chromatographie en phase inverse (environ 30 vs. >100μmol ligand/mL gel)

 

2. Concentration & type de sels – Série de Hofmeister

 

Concentration & type de sels – Série de Hofmeister
  • La série de Hofmeister est la classification des ions en fonction de leur capacité à solubiliser les protéines.
  • Plus la concentration en sel augmente plus les molécules sont hydrophobes.
  • Attention aux risques de précipitation quand les concentrations en sels sont trop fortes.
Effet chaotropique : destruction de la structure tertiaire des macro-molécules Hofmeister serie & effets sur la précipitation

<——————————————-Augmentation de la précipitation (“salting out”)

Anions : PO43- > SO42- > CH3COO > Cl > Br, NO3 > ClO4
Cations : NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+
Augmentation de l’effet Chaotropique (“salting in”)————————>

 

cf: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.

 

3.pH

Augmentation du pH : les interactions hydrophobes décroissent, probablement parce que plus de sites chargés apparaissent, la molécule est donc plus hydrophile.
Baisse du pH : les interactions hydrophobes augmentent, la molécule étant plus hydrophobe.

 

4. Température

Globalement les interactions hydrophobes augmentent lorsque la température augmente. Ceci est dû à l’effet entropique et aux forces de Van der Waals.
Cependant la protéine peut être dénaturée, sa solubilité en solution est modifiée et conduit à sa précipitation.

 

 

HIC pour les ADCs

La technique HIC est particulièrement bien adaptée aux purifications des ADC (Antibody Drug Conjugate).

Les ADCs sont des complexes d’anticorps monoclonaux sur lesquels sont liés de façon stable des molécules cytotoxiques biologiquement actives.
La conjugation peut être sur les acides amines :

  • Cysteine (e.g. Brentuximab Vedotin)
  • Lysine (e.g. Trastuzumab Emtansin)

Plus de 50 ADC sont en tests cliniques.

La séparation est basée sur le nombre de molécules cytotoxiques liées à l’anticorps.

La séparation est basée sur le nombre de molécules cytotoxiques liées à l’anticorps.

A. Beck et al., Disc. Medicine, 2010, 10, 329-339

 

En savoir plus :